O aproveitamento de subprodutos agroindustriais para a obtenção de biomoléculas tem incentivado o avanço de novas estratégias de produção. O soro de queijo, um substrato rico em lactose, serve como fonte alternativa e de baixo custo para a obtenção da enzima β-galactosidase, comumente empregada na indústria de alimentos. O objetivo do trabalho foi aproveitar o soro de queijo porungo, substrato ainda pouco explorado, para produção da enzima e determinação das características enzimáticas. Neste trabalho, a β-galactosidase foi produzida pelo cultivo de Kluyveromyces marxianus CCT 4086, em meio de cultura à base de soro de queijo porungo. As fermentações foram conduzidas em shaker a 180 rpm, a 30°C, pH 7,0. O extrato bruto obtido foi analisado quanto às condições ótimas de atividade da enzima quanto a temperatura (20-60 ºC) e pH (5,5-8,0). A atividade enzimática máxima foi de 14,52 U ml^-1 em 15 h de cultivo, consumindo 85 % da lactose (7,69 g L^-1). A enzima apresentou atividade ótima a 37 ºC e pH 6,5. O soro de queijo mostrou potencialidade para a síntese da enzima β-galactosidase, agregando valor a este, e simultaneamente, reduzindo os impactos ambientais ocasionados pelo descarte inadequado.